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近年来，随着纳米技术的发展，许多金属及非金属的无机纳米颗粒被用于各种疾病的治疗。其中，纳米硒（Se NPs）因其毒性低、生物利用度高、活性高成为硒类物质研究和发展的焦点。但纯的 Se NPs不稳定，在水溶液中容易聚集，因此保持其良好的水溶性和稳定性，在制备过程一般要添加分散剂或保护剂使其在水溶液中稳定分散。
化学类表面活性剂虽然对纳米硒有较强的分散能力，但因其本身的毒性使纳米硒在生物活性方面的应用受限。核酸、蛋白质和多糖等天然生物大分子，由于其本身的生物相容性好，被更为广泛的用于构建生物医用材料。如Meng等利用多糖-亚硒酸钠螯合法制得一种新型的水溶性黄芪多糖纳米硒（Se-APS）。
结果表明，Se-APS含硒量高、水溶性好、副作用小，不仅能够促进T淋巴细胞的增殖，还能够抑制HepG2细胞的恶性增殖，减少细胞的迁移和侵袭。Zhu等探讨了石笋多糖（ULP）稳定的Se NPs对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎产生保护作用。因此，开发多糖-纳米硒复合物对临床疾病的治疗具有重要的意义。
黑木耳是生长在朽木上的一种腐生菌，具有补脾益气、止咳润肺、延缓衰老、辅助降血糖降血脂及抗癌等功效。黑木耳的主要活性成分为多糖，目前已有多篇研究报道了从黑木耳中提取得到的不同结构的多糖，并证明了他们具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、降血脂及免疫调节等功效。
在本课题组前期研究中，发现从黑木耳中提取的一种多糖，可在水中自组装成树枝状纳米管（DNTs），这种中空纳米管结构可以负载多种客体分子，如DOX药物、Pt（IV）前药、聚集诱导发光（AIE）染料以及金、银纳米粒子。并在治疗中展现出优良的疗效。然而，该复合物作为一种新型制剂，其制备工艺并未进行过系统研究，阻碍其作为药物的深入开发。
因此，本文拟通过系统的制备工艺考察来探索DNT-Se复合物的最优制备条件。有研究表明，在纳米硒的制备工艺中，多糖浓度、维生素C与亚硒酸钠的比例、反应温度等都是制备理想纳米颗粒的重要因素。因此，本文对黑木耳β-葡聚糖/纳米硒复合物（DNT-Se）的制备工艺进行考察，主要研究黑木耳β-葡聚糖溶液浓度、维生素C和亚硒酸钠配比、反应温度、反应时间、亚硒酸钠浓度等反应条件对DNT-Se复合物粒径的影响，采用单因素考察结合正交试验进行比例筛选，从而确定制备DNT-Se的最佳工艺，并考察其对HepG2肝癌细胞增殖的作用。
材料与方法
材料与仪器
黑木耳 湖北房县；乙酸乙酯 天津市富宇精细化工有限公司；氯化钠 天津市大茂化学试剂厂；甲醇；无水乙醇；维生素C；亚硒酸钠 国药集团化学试剂有限公司；氘代二甲基亚砜；溴化钾上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Cell Counting Kit-8 东仁化学科技（上海）有限公司；DMEM培养基 美国HyClone公司；胎牛血清（FBS）美国Gbico公司；双抗（青霉素-链霉素溶液）美国HyClone公司；胰酶（0.25%）美国HyClone公司；磷酸盐缓冲液；美国HyClone公司；二甲亚砜（DMSO）美国Sigma公司。
Implen超微量紫外分光光度计N60北京诺汇诚生物科技有限公司；傅里叶红外光谱仪Nicolet 6700赛默飞世尔科技有限公司；压片机YP-2 上海山岳科学仪器有限公司；核磁共振仪Mercury VX-300 Varian Mercury公司；高效液相色谱仪 LC-10A Shimadzu；示差检测器 RI-10A Shimadzu；色谱柱BRT105-104-102串联凝胶柱 BRT105-104-102 (8 mm × 300 mm ) BoRuiSaccharide；粒径测定仪 Nano-ZS90 马尔文仪器有限公司；透射电镜 JEM1400 日本JEOL有限公司；扫描式电子显微镜 QUANTA200 FEI公司；X射线衍射仪 XPertPro 荷兰帕纳科公司；X射线光电子能谱仪 ESCALAB250Xi Thermo FisherScientific。
实验方法
黑木耳β-葡聚糖的提取、分离及表征
按照参考文献的方法，黑木耳粉碎后，分别使用丙酮、乙酸乙酯回流4 h脱脂，将脱脂粉末烘干后使用70% 乙醇溶胀24 h后用0.9% NaCl提取，收集上清，然后使用Sevage法脱蛋白、H2O2脱色，透析7天后冻干即得黑木耳多糖。按照参考文献的方法，采用苯酚-硫酸法对黑木耳β-葡聚糖的总糖含量进行测定。
将冻干的黑木耳多糖配制成多糖溶液，使用紫外分光光度计测定样品溶液在490 nm处的吸光度值，利用标准曲线计算样品的总糖含量。使用傅里叶红外光谱仪，采用溴化钾压片法采集黑木耳β-葡聚糖的红外光谱，检测范围为400-4000 cm-1。另取30 mg黑木耳β-葡聚糖冻干品溶于1mL氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）中，置于核磁仪上进行测定以得核磁共振（NMR）谱图，测定温度为25℃。
黑木耳β-葡聚糖/纳米硒复合物（DNT-Se）的制备
将β-葡聚糖于60℃溶于蒸馏水(1 mg/mL),冷却至室温，即可通过其在水中自组装得黑木耳β-葡聚糖纳米管，命名为DNTs。纯纳米硒对照组（Se-NPs），采用Vc还原法制备。将Vc水溶液逐滴滴加到亚硒酸钠水溶液中，即可得到纳米硒粒子，命名为Se-NPs。DNT-Se的制备方法类似，将黑木耳β-葡聚糖配制成终浓度为1 mg/mL的多糖溶液，待完全溶解后逐滴滴加0.1 mol/L的亚硒酸钠（Na2SeO3）水溶液，搅拌30 min后再按照维生素C与亚硒酸钠配比为4:1（n/n）逐滴滴加维生素C水溶液，于25 ℃反应24 h。之后转入透析袋中（MWCO 3000）透析，冷冻干燥即得多糖/纳米硒复合物，命名为DNT-Se。
β-葡聚糖/纳米硒复合物粒径的评价指标
双波长吸光度比值法
将浓度为1 mg/mL DNTs、1 mg/mL维生素C溶液以及1mg/mL维生素C+1mg/mL DNTs（v/v=1:1）、1mg/mL DNTs+1mg/mL维生素C+1mol/L亚硒酸钠溶液（v/v=1:1）,进行紫外全波长扫描（200-800nm），确定波长λ1（410nm）、λ2（490nm）的吸光度A1、A2，并计算A1/A2的值，以各因素为横坐标，以波长比（A1/A2）为纵坐标，绘制曲线图，以比值大小判断DNT-Se复合物的粒径大小，每个样品重复3次。
粒径仪测定法
将所得的DNT-Se置于马尔文激光粒度仪中，稳定120 s，于25 ℃下测定DNT-Se复合物的粒径，每个样品重复3次。
DNTs-Se粒径的单因素考察
分别考察DNTs浓度、亚硒酸钠浓度、维生素C与亚硒酸钠配比、反应温度、反应时间对DNT-Se形成的影响。分别配制浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的DNTs溶液，其他条件保持不变，考察DNTs浓度对DNT-Se形成的影响；保持其他条件不变，考察0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L的亚硒酸钠溶液对DNT-Se形成的影响；精密称取维生素C与亚硒酸钠，使二者终配比为2:1、3:1、4:1、5：1、6:1（n/n物质的量之比），考察维生素C与亚硒酸钠配比对DNT-Se形成的影响；分别考察反应温度为25℃、37℃、60℃、80℃时对DNT-Se形成的影响；在保持其他条件不变的条件下分别考察反应3、6、12、24、36 h对DNT-Se形成的影响。
正交试验优化DNT-Se的制备工艺
以DNTs-Se粒径大小的单因素考察实验结果为依据，选取三种因素作为实验对象，将最适宜的条件作为中间水平，以L9（34）设计正交因素水平表为模板，按照实验进行正交试验，以对DNT-Se的制备进行进一步的优化。
表1正交设计中的因素与水平
因素 | 代号 | 水平 | ||
1 | 2 | 3 | ||
DNTs浓度（mg/mL） | A | 0.5 | 1.0 | 1.5 |
Vc：Na2SeO3(n/n) | B | 4:1 | 5:1 | 6:1 |
CNa2SeO3(M) | C | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
黑木耳β-葡聚糖/纳米硒复合物（DNT-Se）的形貌表征
DNT-Se的形貌特征通过透射电子显微镜（TEM）来观察。取一滴新制备的DNTs、Se NPs及DNT-Se溶液分别小心滴于100目的铜网上，待样品被吸附10 min后，用滤纸吸走各剩余样品溶液，室温下晾干铜网，通过TEM观察依次各样品的微观形态。同时用能量色散光谱仪对其表面积断面进行观察，加速电压为5 kV，测试前均进行喷金操作。
细胞增殖实验
采用CCK8法检测DNT-Se等样品对各种细胞增殖抑制的情况。首先采用该法检测DNTs、Se NPs及DNT-Se对HepG2肝癌细胞的增殖抑制情况。将处于对数生长期的HepG2细胞消化，加适量完全培养基轻吹散成细胞悬液，并用细胞计数器计数以便进行密度换算。
将细胞混悬液稀释后以1.0×104个/孔的密度分别接种于96孔板内，于细胞培养箱中待其贴壁。贴壁后将含有一定浓度梯度的DNTs、Se NPs、DNT-Se培养基（6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）分别加入到各孔中，同时建立无药物、无细胞的空白组和无药物、有细胞的对照组，每组设置4个复孔，置于培养箱中继续分别培养24、48、72 h。
接着采用该法检测DNT-Se对293T人胚胎肾细胞及AML-12小鼠正常肝细胞活性的影响，以进一步确定DNT-Se的生物安全性。将293T细胞和AML-12细胞接种于96孔板，待其贴壁。之后加入含有一定浓度梯度的DNT-Se培养基（6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL），同时建立无药物、无细胞的空白组和无药物、有细胞的对照组，每组设置4个复孔，置于培养箱中继续培养48 h。
以上三种细胞终止培养后，每孔加入无菌PBS清洗细胞2次以洗净培养基，在加入100 μL含10% CCK8培养基，于培养箱中继续孵育20min，最后用酶标仪在450 nm处检测每孔的吸光度OD值。用下式计算各细胞的存活率，用Graphpad prism 7.0计算药物的半数致死浓度（IC50）：
Cell viability（%）=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%
统计学方法
采用 Graph Pad Prism 7.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以x±s 表示，多组间均数采用 One-Way ANOVA 检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
黑木耳β-葡聚糖的理化性质表征
所得多糖采用苯酚-硫酸法测得总糖含量为94.1%，因前期已通过色谱洗脱、甲基化分析等手段对黑木耳β-葡聚糖的平均高度、长度、分子量、链构象等进行了详细的表征，故本文仅对该多糖进行初步验证并与之对比，从而确证二者的相似性。黑木耳葡聚糖在890 cm-1处有明显的吸收峰，为β构型的特征峰，结合前期研究，该黑木耳多糖为β-葡聚糖。
采用核磁共振氢谱和碳谱分析黑木耳β-葡聚糖的连接方式。在13C核磁共振谱中未发现典型的糖醛酸信号（176.5 ppm），表明β-葡聚糖是中性多糖。黑木耳β-葡聚糖在74.26 ppm处C2t积分值（侧链）和在72.99 ppm处C2（主链）积分值的比值为1：1.4。与前期报道黑木耳多糖的NMR特征峰等进行对比可确定其化学结构为主链上每三个β-(1,3)-葡萄糖主链带有两个β-(1,6)-葡聚糖的侧链。
表2黑木耳β-葡聚糖的1H和13C NMR化学位移
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||||||
2m,d | 2t | 3m,d | 3t | 4m,d | 4t | 5 | 5m | 6m,t | 6d | ||
1H | 4.24 | 3.31 | 2.93 | 3.20 | 3.10 | 3.16 | 3.28 | 3.67a | |||
13C | 103.5 | 73.0 | 74.2 | 86.6 | 77.2 | 69.0 | 70.6 | 76.7 | 75.2 | 61.4 | 69.0 |
注：m、d和t分别代表1,3-葡萄糖链、1,3,6-葡萄糖和末端葡萄糖 | |||||||||||
黑木耳β-葡聚糖的近红外图谱（A）、核磁共振氢谱（B）、核磁共振碳谱（C）及其结构式（D）
黑木耳β-葡聚糖/纳米硒复合物（DNT-Se）的制备工艺研究
不同溶液的全扫描吸收光谱
根据之前报道的胶体溶液双波长法可知，硒纳米颗粒的粒径参数ε=lg(A2/A1) / lg（λ1/λ2），其中 A1、A2分别表示样品在波长λ1、λ2下的吸收值。可用A1/A2的比值来表征纳米硒的粒径变化，当比值不变时，纳米硒的粒径不再发生变化；比值越大，纳米硒的粒径越小，形貌越稳定。
从实验中可以看出，DNTs、Vc及二者的混合样品在200-300 nm范围内有明显的吸收峰，但在300-600 nm范围内无明显吸收；而DNTs+Vc+Na2SeO3（总反应介质）在200-600 nm处均有吸收，且峰值较宽，说明在加入Na2SeO3后生成了一定的纳米硒，因此在300-600 nm范围内选取410 nm和490 nm作为纳米硒的测定波长，并以A410/A490作为表征纳米硒粒径随时间变化的依据及指标。
图2 不同溶液的UV-vis全扫描吸收光谱
单因素考察实验结果
DNTs浓度对DNT-Se形成的影响
本试验以黑木耳β-葡聚糖溶液DNTs作为模板剂，研究了DNTs浓度对DNT-Se复合物粒径的影响。随着DNTs浓度的增加，A410/A490的数值呈现先上升后下降，在DNTs浓度为1.0 mg/mL 时A410/A490达到最大值2.549±0.025。
同时，DLS结果中，DNT-Se复合物的粒径出现先减小后增大的趋势，在1.0 mg/mL DNT-Se的粒径最小。将各组溶液放置7 d后，均未发现聚沉等现象，可初步说明各组的稳定性良好。因此，选择1.0 mg/mL DNTs作为反应体系中DNTs的浓度。
表3 不同DNTs浓度对纳米硒的粒径及A410/A490的影响
DNTs浓度(mg/mL) | A410/A490 （双波长比色法） | DNT-Se粒径(nm) |
0.1 | 1.796±0.008a | 49.37±9.61Ab |
0.5 | 1.798±0.002a | 36.86±4.44Bb |
1.0 | 2.549±0.025b | 32.30±6.62BCa |
1.5 | 2.384±0.030ab | 41.04±3.73Bb |
2.0 | 2.313±0.041ab | 39.71±6.03Bb |
注：同列标有不同大写字母者表示组间差异极显著（P<0.01）；标有不同小写字母者表示组间差异显著（P<0.05）；标有相同小写字母者表示组间差异不显著（P>0.05）。 | ||
维生素C与亚硒酸钠的配比对DNT-Se形成的影响
固定反应体系中亚硒酸钠的终浓度为0.1 mol/L，Vc的量对反应的影响主要表现在体系中的亚硒酸钠是否得到完全反应，能否生成足够量的纳米硒。判断反应完全的程度的最直观的变化则是溶液颜色的深浅，越深表明纳米硒生成量越多，同时，A410、A490也可能会越大并且趋于稳定。从实验中可以看出，随着VC/Na2SeO3的升高，吸光值 A410、A490逐渐升高，同时A410/A490逐渐增加，这说明溶液中越来越多的亚硒酸钠参与了反应。
而当比值达到5：1之后，A410/A490呈现下降的趋势，这说明当 VC/Na2SeO3达到5：1之后，反应体系中的亚硒酸钠得到了完全反应。接着测定了各体系中纳米硒的粒径，发现其在VC/Na2SeO3为5：1时的粒径最小，该结果与双波长比值结果一致。将各组溶液放置7d后，均未发现聚沉等现象，可初步说明各组的稳定性良好。结合该实验结果，故选择VC/Na2SeO3=5：1作为反应体系中维生素C与亚硒酸钠的比例。
表4 不同Vc与Na2SeO3的配比对纳米硒的粒径及A410/A490的影响
nVc:nNa2SeO3 | A410/A490 （双波长比色法） | 纳米硒粒径(nm) （DLS） |
2：1 | 1.646±0.005Ca | 42.85±3.42a |
3：1 | 1.797±0.005Ba | 41.99±5.62a |
4：1 | 2.153±0.012Aa | 40.86±1.79a |
5：1 | 2.183±0.008Ab | 37.88±7.32a |
6：1 | 2.158±0.003Aa | 44.86±1.12a |
注：同列标有不同大写字母者表示组间差异极显著（P<0.01）；标有不同小写字母者表示组间差异显著（P<0.05）；标有相同小写字母者表示组间差异不显著（P>0.05）。 | ||
反应温度对DNT-Se形成的影响
反应温度不仅对纳米硒粒径的大小有影响，而且对作为稳定剂的多糖DNTs也有影响。因此，确定一定的反应温度是至关重要的一环。本试验研究了不同的反应温度对纳米硒形成的影响。从结果中可以得知，随着反应温度的升高，A410/A490逐渐降低，纳米硒粒径逐渐增加，甚至在80 ℃ 时出现了聚沉，因为温度过高会破坏多糖的链状结构，同时其自组装能力也会受到影响，导致整个反应体系不稳定，多糖稳定纳米硒的能力减弱。尽管在25℃、37℃、60℃时均未发生聚沉，但25℃ 时DNT-Se粒径最小，因此，选择25 ℃作为制备DNT-Se的最佳反应温度。
表5不同反应温度对纳米硒的粒径及A410/A490的影响
反应温度(℃） | A410/A490 （双波长比色法） | 纳米硒粒径(nm) （DLS） |
25 | 2.085±0.015A | 37.65±2.64a |
37 | 2.047±0.010A | 42.41±3.10ab |
60 | 1.882±0.008B | 49.06±5.70b |
80 | ——* | —— |
注：“*”表示所得的DNT-Se为浑浊物，无法进行相关测定。同列标有不同大写字母者表示组间差异极显著（P<0.01）；标有不同小写字母者表示组间差异显著（P<0.05）；标有相同小写字母者表示组间差异不显著（P>0.05）。
反应时间对DNT-Se形成的影响
与反应温度对纳米硒粒径大小的影响一样，反应时间对纳米硒的粒径也有着重要影响。因此，本试验也探究了反应时间对纳米硒形成的影响。从结果中可以看出，反应时间在12 h内，随着反应时间的增加，A410/A490也逐渐增加，纳米硒粒径逐渐减小。
当反应时间大于12 h时，A410/A490开始降低，纳米硒粒径增加。在反应温度一定时，随着反应时间的延长，体系中生成的纳米硒逐渐增多，溶液的颜色会出现浅黄色→橙色→红色的变化，A410/A490增加，DNT-Se粒径减小。但反应时间过长，纳米硒会发生集聚，硒纳米粒子的粒径增大，溶液的颜色会由红色变为砖红色，甚至出现红色沉淀。因此，反应时间不宜过长，故选择12 h作为制备DNT-Se的反应时间
表6不同反应时间对纳米硒的粒径及A410/A490的影响
反应时间(h） | A410/A490 （双波长比色法） | 纳米硒粒径(nm) （DLS） |
3 | 1.812±0.007Cab | 49.25±7.16a |
6 | 1.845±0.005Cabc | 41.25±7.52ab |
12 | 2.092±0.019Aabc | 35.76±7.45ab |
24 | 2.039±0.013Abc | 40.16±4.38ab |
36 | 1.913±0.007Babc | 44.93±6.37a |
注：同列标有不同大写字母者表示组间差异极显著（P<0.01）；标有不同小写字母者表示组间差异显著（P<0.05）；标有相同小写字母者表示组间差异不显著（P>0.05）。 | ||
亚硒酸钠浓度对DNT-Se形成的影响
本课题最主要的目的是在纳米硒分散且稳定的前提下，利用DNTs负载尽可能多的纳米硒。因此纳米硒的浓度至关重要。随着浓度的增加，A410/A490逐渐减小，纳米硒粒径也呈现增加的趋势；在浓度为1.2 mol/L时，样品出现了聚沉现象。实验数据表明，0.6、0.8、1.0 mol/L的A410/A490与粒径相差不大，结合实验的目的，选择Na2SeO3为1.0 mol/L作为反应体系中亚硒酸钠的浓度。
表7 不同Na2SeO3浓度对纳米硒的粒径及A410/A490的影响
CNa2SeO3(M) | A410/A490 （双波长比色法） | 纳米硒粒径(nm) （DLS） |
0.6 | 2.158±0.043 a | 37.93±4.70a |
0.8 | 1.832±0.003b | 41.79±1.96a |
1 | 1.795±0.016b | 43.40±3.08a |
1.2 | —— | —— |
注：同列标有不同大写字母者表示组间差异极显著（P<0.01）；标有不同小写字母者表示组间差异显著（P<0.05）；标有相同小写字母者表示组间差异不显著（P>0.05）。 | ||
正交试验优化DNT-Se的制备工艺
基于前述单因素实验的结果及本课题的主要目的，选择DNTs浓度、维生素C与亚硒酸钠的配比和亚硒酸浓度作为因素，选择最适宜的条件作为中间水平，各设三个水平，第四个因素为空白组，作为本实验的误差列，采用四因素三水平L9设计正交实验表，继续优化DNT-Se的处方，优化指标为纳米硒粒径。
表8 正交实验设计与结果
试验编号 | 水平 | 纳米硒粒径（nm） （DLS） | |||
A DNTs浓度 | B nVc:nNa2SeO3 | C CNa2SeO3 | 空白 | ||
1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 47.56 |
2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 46.22 |
3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 44.28 |
4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 37.97 |
5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 40.12 |
6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 39.64 |
7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 43.87 |
8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 47.06 |
9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 44.70 |
K1 | 138.1 | 86.3 | 89.5 | 88.3 | |
K2 | 78.5 | 88.9 | 85.9 | 86.5 | |
K3 | 90.4 | 85.7 | 85.5 | 86.2 | |
`K1 | 46.020 | 43.133 | 44.753 | 44.127 | |
`K2 | 39.243 | 44.467 | 42.963 | 43.243 | |
`K3 | 45.210 | 42.873 | 42.757 | 43.103 | |
R | 6.8 | 1.6 | 2.0 | 1.0 | |
表9 正交实验结果方差分析
因素 | 偏差平方和 | 自由度 | F比 | F临界值 | 显著性 |
A | 82.180 | 2 | 44.494 | 19.000 | * |
B | 4.384 | 2 | 2.374 | 19.000 | |
C | 7.233 | 2 | 3.916 | 19.000 | |
误差 | 1.850 | 2 |
对正交实验的结果，以DNTs-Se粒径大小为指标，进行直观分析及方差分析，以空白组作为误差项，因素A、B、C的F值与临界值比较后可知，因素A不同水平对纳米硒的影响有显著性差异，即DNTs浓度对纳米硒的影响显著。各因素对纳米硒粒径的影响程度为A＞C＞B。根据正交实验结果，得出最佳方案为A2B3C3。
验证实验
运用正交试验所得的最优条件进行5组实验对其进行验证，即DNTs浓度1.0 mg/mL，维生素C与亚硒酸钠配比6:1，亚硒酸钠浓度为1.0 mol/L。5次验证试验的结果中纳米硒粒径分别为33.59、35.10、34.48、35.32、34.01 nm，5次验证实验中纳米硒粒径的均值为34.48±0.71 nm。故选择A2B3C3作为最佳制备条件。
黑木耳β-葡聚糖/纳米硒复合物（DNT-Se）的形貌表征
DNTs在水中可自组装成为平均直径约为200 nm的树枝状的中空纳米纤维。而没有分散剂的纯Se NPs则聚集成团且粒径较大，约为220 nm。显然，因DNTs的存在，Se NPs不再聚集成团，而是均一、单一地分散于DNTs的中空纳米管中，与前期文献报道相符。
DNT-Se形态良好，粒径较小，约为30.9 nm，而正交试验所得的粒径大小约为34.78 nm，这是因为正交验证时中测量粒径时DNT-Se是以一个液体的状态存在，多糖在溶液中会有一定的体积膨胀。而透射电镜中，DNT-Se是处于干燥状态的。此时的粒径确实会与溶液状态下粒径大小具有一定的差异。
细胞增殖实验
有研究表明，含硒的材料通过诱导细胞凋亡而发挥抗癌活性。故为考察各样品对肝癌细胞和正常细胞的作用，我们采用CCK8法对DNTs、Se NPs及DNT-Se对HepG2细胞的作用进行了探讨。由A可知，DNTs与细胞作用72 h后，在最高浓度下存活率仍高于75%，说明DNTs基本不杀死细胞，也可推测其基本不引起细胞凋亡；由B可知，200 μg/mL的Se NPs与细胞作用48 h后，在最高浓度下存活率大于92%，而当其作用时间达72 h时，其存活率显著下降且与48 h时存在显著性差异；由C可知，随着DNT-Se与细胞共孵育的时间的增加，其存活率逐渐降低。
对三个时间段的半数致死浓度进行计算得，DNT-Se在24、48、72 h的IC50分别为412.81 μg/mL、125.64 μg/mL、42.54 μg/mL。可见，DNT-Se对HepG2细胞的作用具有时间依赖性。且在各时间段内，DNT-Se组的IC50均低于Se NPs组，可说明经DNTs分散后的制剂能使更多的Se NPs进入肝癌细胞，从而更好地发挥抑制癌细胞增殖的作用。考虑到制剂在体内的代谢情况，后续实验拟采用48 h作为DNT-Se及各组样品与细胞的作用时间。
为了进一步考察DNT-Se对正常细胞的影响，我们采用293T人胚胎肾细胞及AML-12小鼠正常肝细胞的CCK8实验以确证其安全性。DNT-Se分别与293T细胞和AML-12细胞作用48 h后，即使在最高浓度（200 μg/mL）时，其细胞存活率仍高于82%，说明DNT-Se对正常细胞并无毒性作用，具有良好的生物安全性。
图4 HepG2细胞分别与DNTs（A）、Se NPs（B）、DNT-Se（C）孵育24、48、72 h后的细胞存活率、DNT-Se与不同细胞孵育48 h后的细胞存活率（D）(n=4) (*P＜0.05,**P＜0.01；n=4)
本文采用原位还原法制备黑木耳β-葡聚糖/纳米硒复合物（DNT-Se），考察了DNTs浓度、维生素C与亚硒酸钠配比、反应温度、反应时间、亚硒酸钠浓度对DNT-Se粒径大小的影响，最终确定DNT-Se的最佳制备工艺为DNTs浓度1.0 mg/mL，维生素C与亚硒酸钠配比6:1，亚硒酸钠浓度为1.0 mol/L，反应温度为25 ℃，反应时间为12 h，所得DNT-Se粒径平均值为34.78 nm。细胞增殖实验结果表明，DNT-Se对293T人胚胎肾细胞及AML-12小鼠正常肝细胞基本无毒性，但是对HepG2肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，且其对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用明显优于Se NPs。本研究为多糖/纳米硒复合物的研究奠定了基础。
《黑木耳多糖的提取、功能及单糖组成的研究》
《纳米硒的制备与应用研究进展》
《黑木耳多糖的螺旋链构象及其生物医学应用》
